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临床分子检验项目的检验程序验证与确认

摘要
分子检验项目在临床的应用越来越广泛,对分子检验项目检验程序的验证或确认是其临床应用的前提,建立适用于临床分子检验项目检验程序的验证或确认模型,有助于临床分子检验从业人员更便捷、高效地开展验证和确认工作,对检测标准化和质量控制有着重要的意义。本文将从分子检验项目验证与确认现状,ISO15189认可体系的要求、验证确认模型的建立及展望等方面进行阐述。


近年来,随着精准医学概念的深化,分子诊断技术在临床中的应用突飞猛进,极大的促进临床诊疗水平。但临床分子检验项目因为技术本身的复杂性而蕴藏着极大的风险,运用不当有可能漏诊、误诊、未能及时适当治疗等[1],加之,实验室检验的目的是为了获取准确的结果,但若质量管理不规范就可能出现误差,导至结果不准确。因此,分子检验项目在应用前对检验过程进行严格合理的确认(validation)和(或)验证(verification)就显得尤为重要。


众所周知,ISO15189认可体系的实施使检验过程处于持续改进的进程中,ISO15189体系中临床分子检验项目检验过程的验证和确认相关内容,同样也是一个不断完善的过程:从ISO15189∶2007仅在5.5条款提出检验程序的相关要求到ISO15189∶2012在5.5条款明确了检验程序验证和确认的概念及二者的适用范围。但即便如此,最新版的ISO15189体系文件依然没有给出临床分子检验项目检验过程验证与确认的标准化模型。医学实验室中关于性能验证的要求,美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定了一系列的标准,但临床分子检验项目有它的特殊性,临床检验工作者投入的关注相对较少,可供借鉴的经验十分有限。故建立临床分子检验项目检验程序的验证与确认模型非常有必要。


一、临床分子检验项目的分类

临床分子检验项目按照检测对象或目的可大致分为:感染性疾病分子检验项目、基因组相关疾病分子检验项目、肿瘤相关分子检验项目、用药指导分子检验项目和其他(移植配型、亲子鉴定、ABO血型核酸扩增定性检测)等。按照检测过程中采用的分子诊断技术可分为:PCR技术相关分子检验项目、Sanger测序技术相关分子检验项目、二代测序(next generation sequencing,NGS)技术相关分子检验项目、原位杂交技术相关分子检验项目等。此外,还可以分为需进行验证(Verification)的项目(常规项目和检验程序经修改未超适用范围的项目)和需进行确认(Validation)的项目[实验室自建分子检测项目(laboratory developed molecular tests,LDMTs)和检验程序经修改超适用范围的项目]两大类。临床分子检验项目无论怎样分类,无论哪一类临床分子检验项目,临床应用前其检验程序都需经过相应的方法学确认和/或验证,具体对应关系如图1所示。

图1?临床分子检验项目分类与检验程序验证或确认的对应关系


二、ISO 15189认可体系对验证和确认的要求

ISO15189认可体系对方法学验证的要求是一个持续改进的过程,最新版认可体系文件(ISO15189∶2012)及CNAS-CL02-A009∶2018《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》对确认和验证的适用范围、实验室自建方法、超既定验证范围的方法、验证后经修改的方法、验证程序的要素等给出了框架性的条款,为工作人员在具体实施程序制定时提供了灵活选择的空间。其对方法学验证相关术语中确认和验证进行了统一和明确[2,3]。中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service For Conformity Assessment,CNAS)制定的《分子诊断检验程序性能验证指南》对临床分子检验项目进行性能验证做了进一步的解释和指导,其侧重于验证内容的阐述,确认相关内容有待进一步探索累积经验。


三、ISO 15189认可体系内临床分子检验项目检验程序验证和确认模型

临床分子检验项目检验过程验证和确认程序基本步骤相同,主要区别在于实施过程中所采用的性能参数不同、选择性能参数时的依据不同,验证时主要依据生产制造商声明,确认时主要依据实验室的预期用途,具体如图2所示。

图2?验证与确认模型示意图(*表示过程有差异)


1.时机评估:
对于LDMTs或检验程序经修改超适用范围的项目须对现行检验程序进行确认。对于经批准准备临床开展的检验程序或检验程序经修改仍然在适用范围内的项目或发生影响检测系统分析性能的情况(如仪器故障、搬迁、设施环境严重失控等)须对现行检验程序进行验证。

2.方案设计:
对于须确认的检验程序,因其项目涉及范围广、灵活多变,而导至确认实验复杂多变。其确认方案制定时需遵循以下几点:(1)资料收集:查阅公认的项目相关疾病的临床诊治指南、经典文献,以明确该分子检验项目技术背景、用途、实验步骤、质控和对照方法、样本类型和采集原则、TAT时间和报告形式等方面的信息。(2)选择性能参数:方法学确认的特点是应尽可能全面,其性能参数宜但不仅限于正确度、准确度、精密度、测量不确定度、分析特异性、分析灵敏度、抗干扰能力、检出限、可报告范围、参考范围等(具体方案选择见表1),临床敏感性、临床特异性为可选用的性能参数,实验室要求较高且样本数量较为容易收集的临床诊断项目可选择进行实验[4]。(3)确定判断标准:宜参考国标、行标、公开发表的指南和专家共识等合理制定实验室判定标准。


对于须验证的检验程序,可按照CNAS制定的相关指南(如《分子诊断检验程序性能验证指南》)设计验证方案,性能参数具体方案选择见表1。

3.实验准备:
实施验证或确认实验前需做如下准备:(1)人员:实施验证或确认实验的人员须为实验室具有相关资质的实验操作人员,其应该熟悉方法原理与操作(包括样品处理、校准、维护程序、质量控制),了解确认或验证方案;(2)环境:确保实验室设施及环境符合分析系统工作要求,仪器经校准并合格,确保检测系统工作状态正常;(3)样本:实验样本需经相关程序确认符合实验要求;(4)核酸提取效率评估:确认程序须对提取效率进行评价,以确保满足要求,验证程序须使用配套或生产制造商推荐的核酸提取试剂,必要时进行评价。其中,核酸提取效率评价宜包括:浓度,纯度和完整性。

4.实验实施与完成报告:
实验过程须严格遵照制定的验证或确认方案,依据样本检测程序进行。既定实验方案执行完毕后还需进行:(1)数据分析;(2)结果评价;(3)生成报告,所有涉及的性能参数结果和判定过程亦需包含于内,然后交由主任审核同意并签字生效。

最后,临床分子检验项目检验程序的验证或确认完成后,需完善科室层面的生物安全内容、标准操作规程、人员培训计划、仪器相关事项、信息系统内容、能力验证计划等[5,6]


四、临床分子检验项目方法学验证和确认的展望
1.国内临床分子检验项目方法学验证和确认尚属薄弱环节,正累积经验:
目前国内各级医疗机构能够提供的临床分子检验项目相对局限,主要集中于传染性疾病、少量遗传性疾病、代谢相关基因和肿瘤相关基因的检测,LDMTs对于大多数医疗机构还比较陌生,对相关方法学验证和确认程序关注度有限[18],ISO15189∶ 2012、CAP、《医学实验室质量和能力的专用要求》、《上海市医学实验室质量和能力的专用要求》等对于临床分子诊断方法学验证均有提及,针对不同的管理需求提出了不同的要求[19,20]


2.临床分子检验项目方法学验证和确认是循证医学的具体实践:
循证医学(evidence-based medicine,EBM)的核心是医疗决策应在现有的最好的临床研究依据基础上作出。对于临床诊断而言,性能验证或确认程序为其提供了可信、可用的临床诊断依据。故从循证医学的角度,实验室无论是否进行ISO15189认可,在项目开展前也应该做这项工作。


3.方法学验证的要求是一个持续改进的过程:
持续改进是ISO15189认可体系的核心理念之一,即便我们给出了验证或确认模型,也不一定适用于所有情况,需要我们以持续改进的思想看待方法学验证和确认这项工作。最后,临床分子诊断从业人员也应该以持续改进的心态迎接行业的不断变革,并且以审慎的态度对待方法学验证要求的变迁。
来自: 中华检验医学杂志
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