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指南共识 | 血液肿瘤二代测序实验室检测规范化的建议

二代测序(NGS)技术对血液肿瘤的诊疗具有重要意义,2016年世界卫生组织(WHO)对《造血与淋巴组织肿瘤分类》内容进行了更新,依据NGS技术所发现的基因突变新增了一些血液肿瘤的类别。此外,美国国家综合癌症网络(national comprehensive cancer network,NCCN)血液肿瘤临床诊疗指南纳入的具有明确预后意义的突变基因也越来越多。国内临床实验室由于缺乏明确的技术要求,影响了血液肿瘤NGS检测的规范化及质量的提高。为了科学、合理地将NGS应用于血液肿瘤的筛查、诊断、疗效监测、预后评估和复发预测,项目组依据国内外指南及共识,组织血液学专业的临床及检验专家反复讨论,并多次到专家所在实验室现场调研,初步提出了血液肿瘤二代测序实验室检测规范化的建议,内容包括对人员资质的要求、实验室区域设置及环境要求、测序平台及方法的选择、测序平台及方法的性能验证/确认、分析前和分析中的要求、质量控制和结果报告的要求等。


相对于实体肿瘤,血液肿瘤中已经列入诊疗指南的分子指标更多,同时也对NGS的应用有着更为迫切的需求。此外,骨髓、外周血和淋巴结等新鲜肿瘤样本容易取材,容易获得高质量的肿瘤组织的核酸样本。本建议的提出旨在抛砖引玉,希望在此基础上更加广泛地收集临床医生与检验同道的意见,进一步明确并制订既满足临床需要又符合国情的技术要求,便于临床实验室规范操作,更好地服务于临床。


一、人员资质的要求

NGS是一项复杂的检测技术,涉及不同岗位人员的分工协作。由于不同岗位人员的职责不同、需要具备的能力也不同,需要针对不同岗位的人员资质分别制订要求。


1.检测人员:

应具备临床检验、分子生物学等专业背景,曾接受过NGS技术的理论和实验培训并经考核合格,同时参加了省级以上卫生行政部门组织的临床基因扩增实验室技术培训,并获得培训合格证书。


2.生物信息分析人员:

应具有生物信息学专业背景,并经相应培训考核合格后方可上岗。


3.报告分析人员:

报告分析人员应具有大学本科以上学历,同时具备临床医学(特别是血液学)、临床检验、分子生物学或遗传学专业背景,并经培训合格后上岗。最终报告应由中级职称及以上或硕士以上学历并具有相关专业背景的执业医师或授权签字人签发。


4.报告解读人员:

具有执业医师资质,接受过遗传咨询相关培训并获得合格证书,同时具备临床医学(特别是血液学)、临床检验、分子生物学或遗传学专业背景。


二、实验室区域设置及环境要求

NGS实验室的区域设置原则上需要满足《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的要求,在不影响检测质量的前提下,分区可依据实际情况适当合并。NGS实验室分区的要求目前在业内存在一定争议,有专家认为分区设置必要性不大且浪费空间,项目组考虑到目前不同层级实验室的管理能力差异较大,为方便实验室进行质量管理,确保检测质量,建议实验室至少设置五个功能区:试剂存储和准备区、标本与文库制备区、文库扩增与检测区、测序区、数据分析与存储区。各区域的功能和相关要求如下。


1.试剂存储和准备区:

用于消耗品和试剂的存储和准备。消耗品和试剂应直接运送至该区域,不能经过文库制备区,试剂盒中的阳性对照及质控品不能保存在该区,应存储于标本与文库制备区。


2.标本与文库制备区:

用于核酸(RNA、DNA)提取与存储;文库制备和杂交捕获。应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。本区域设置正压条件(通常维持5 Pa的正压),以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。对具有潜在传染危险性的材料,应在生物安全柜内开盖和处理,同时应有明确的标本处理和灭活程序。若开展RNA测序检测,应设置RNA样本提取和样本制备特定区域。


3.文库扩增与检测区:

文库扩增、文库检测与质控。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的走动。所有经过检测的反应管不得在此区域打开。


4.测序区:

用于测序标本上机检测的区域。如Illumina测序平台的温度在22℃左右,且温度波动上下不超过3℃,湿度在30%~75%之间;Thermofisher测台的温度在20~25 ℃,运行温度不超过30℃,详细要求依照厂商说明书。


5.数据分析与存储区:

用于测序数据的分析与存储。数据应进行安全备份,并与互联网物理隔离。规定原始序列核心数据的保存期限。详细说明并记录数据存储路径。应说明数据库是否为云端存储以及数据库更新的程序和管理要求。


三、测序平台及方法的选择

采用不同测序平台及方法的NGS检测各有优缺点,建议实验室依据自身需求结合各平台及方法的性能特点合理选择。


1.测序平台及方法的选择:

至少应考虑如下因素:检测项目类型、待测标本类型、灵敏度要求(应与检测项目相匹配,如平均测序深度大于500×时,可认为≥5%的变异频率较为可信;检测微小残留病灶灵敏度期望达到0.1%甚至更高时,应增加测序深度,配合使用分子标签技术和优化对应的生物信息分析设置,以降低由于测序平台随机误差导致的假阳性结果)、周转时间(宜2周内发报告)、检测标本量、遗传变异的复杂性(对于阳性突变位点,若有必要,应做胚系验证)、生物信息支持的程度、实验室可获得的资源(如生物信息分析及数据存储的硬件设备)、设备购置及性能验证的经费、实验室建立并运行稳定可靠的工作流程的能力。


2.检测试剂的要求:

NGS所用试剂按来源分为商品化试剂和实验室自配试剂。(1)商品化试剂的要求:如条件允许且方法性能满足临床要求,宜优先选用经国家药品监督管理局审批的试剂,实验室应遵循厂家说明书的要求进行性能验证并有记录。(2)临床实验室自建项目(LDT)检测试剂/方案的要求:实验室应结合临床需求开展研究并有记录;针对建库方法、测序平台和分析工具、突变类型以及标本类型进行性能确认;建立满足临床需要的标准操作程序;应有完备的质量控制措施;应进行实验室间结果比对。


四、测序平台及方法的

性能验证/确认

实验室应对测序平台及方法进行验证/确认,并在检测流程变更时进行重新验证/确认。测序平台及方法的验证/确认包括实验操作程序的验证/确认与生物信息分析的验证/确认,两部分验证/确认应整合在一起分析。验证/确认实验可由常规实验室单独完成或由常规实验室与具备相应能力的实验室联合进行,应确保验证/确认实验的可靠性。


(一)实验操作程序的验证/确认

应在验证/确认实验中建立质量控制参数,包括但不限于以下内容:(1)文库制备,包括片段大小分布及文库的浓度;(2)文库稀释的终浓度;(3)足够的测序数据量和Q30达标的比例。


由于人类基因组变异的复杂性(包括胚系和体细胞突变),不可能通过进行一次NGS实验验证/确认标本中所有可能存在的突变的准确性和有效性,可用包含典型突变的标本进行验证/确认实验。


当用同样的实验流程对相同类型的变异进行多次实验时,多次实验得出的结果可以视为方法验证。对于常见病理突变的位点(如JAK2 p.V617F突变及其他血液肿瘤中常见的热点突变),应在验证/确认实验中加入这些常见突变以保证结果的可靠性。对于不同的样本类型,验证样本所需的最少数量,应依据文献报道和相关指南进行考虑。


实验操作部分性能验证/确认的指标至少包括精密度、分析灵敏度(含检出限、检测限)、分析特异性、准确性(适用时)等,分析灵敏度和特异性可以用对照样本中已知位点的信息同时结合一代测序进行验证。


验证/确认或再次验证/确认时,应由实验室主管审批并有书面记录。再次验证/确认实验需覆盖全部或部分步骤,视操作程序的修改程度而定。程序变化较大的例子如改变测序平台或富集方法,变化较小的例子如前期验证过的试剂换了新批号。实验数据应能充分证明当实验操作程序发生改变时,可以达到同等或可接受的性能指标。


(二)生物信息分析的验证/确认

实验室应建立生物信息分析的质量控制参数,包括但不限于:(1)碱基质量和所测序列与参考序列比对的评分;(2)所测序列比对的上靶率;(3)目标区域的序列覆盖度;(4)序列比对评分不足或测序覆盖度过低的目标区域;(5)与参考序列比对后得出的变异数量和类型;(6)外显子组和基因组测序中,所测到的碱基转换与颠换的比例。


实验室应建立生物信息分析标准操作程序(SOP)文件,指导分析、变异注释和标准结果报告流程。对于选用开源的或商用的生物信息分析软件分析NGS测序数据,实验室应根据检测项目确定使用合适版本的分析软件和分析参数,包括注释数据库及附属组件。


实验室同时应建立信息分析流程和相关数据库更新的管理监控流程,并保存更新流程的记录。


实验室应制订保存测序数据、中间处理数据及最后处理数据的相关文件。


实验室应将每份分析报告的分析数据和对应的生信分析流程文件同时保留。


五、分析前的要求

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来自: 中华医学杂志中华医学杂志
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